甘氨酸洗脱抗体原理(2)

发布时间： 2019-04-20

2. 中和缓冲溶液：121.2g Tris (1 M)，87.8g NaCl (1.5 M)，0.37g EDTA (1mM)及5g叠氮化钠(0.5%)溶于1L蒸馏水中，并用HCl调节pH8.0。

3. 洗脱缓冲溶液(pH2.7)：将3.75g甘氨酸(50 mM)溶解于1L蒸馏水中，用HCl调节pH 2.7。

4. 洗脱缓冲溶液(pH1.9)：将3.75g甘氨酸(50 mM)溶解于1L蒸馏水中，用HCl调节pH 1.9。

主要设备

蛋白A柱(含10ml或5ml填料)；泵；离心管；离心机；pH试纸；过滤器；玻璃柱。

实验步骤

1. 准备蛋白A sepharose CL-4B亲和柱

通常准备5ml或10 ml蛋白A sepharose
CL-4B填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS缓冲溶液混合，搅拌。抽真空约15分钟以除去填料中的气泡，否则在柱中形成的气泡影响柱子的容量和分离效果。将蛋白A
sepharose CL-4B填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1 ml/分-2
ml/分，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS缓冲溶液平衡柱子。

2. 制备抗血清

将抗血清放入冰水或4oC冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集。在蛋白质解冻过程中出现的聚集可通过37oC预热而溶解。加入固体叠氮化钠至浓度为0.05%，4oC，15000xg离心5分钟，移出澄清的抗血清再经过滤器过滤除去多余的脂。